Объёмная съёмка мозга рыбки: электрическая линза, Shack–Hartmann и четыре 3D-кадра в секунду
Объём 499 × 499 × 150 мкм³ удалось регистрировать со скоростью 4 полных 3D-кадра в секунду в light-sheet микроскопе для наблюдения нейронной активности личинок данио-рерио. Перенос фокуса по глубине выполняет электрически перестраиваемая линза, а адаптивная оптика компенсирует искажения тракта. Ключевой инженерный вопрос связан с тем, как сохранить коррекцию аберраций в более рассеивающих образцах.
В Biomedical Optics Express опубликована работа группы Bingxi Liu, в которой light-sheet микроскоп зарегистрировал активность мозга личинки данио-рерио в объёме до 499 × 499 × 150 мкм³ со скоростью 4 объёма в секунду. За 2.5 минуты система записала 600 объёмов, что подтверждает заявленный темп непрерывной регистрации. Такой режим позволил наблюдать PTZ-индуцированный эпилептиформный эпизод как пространственно-временной процесс: сигнал возникал в задних отделах мозга, распространялся вперёд в область optic tectum и затухал на масштабе десятков секунд.
Конструкция развивает архитектуру OpenSPIM. Light sheet возбуждает флуорофоры в ограниченной плоскости, поэтому фотонагрузка и фоновая засветка ниже, чем при освещении всего объёма. Главным ограничением объёмной регистрации остаётся перестройка фокуса: серия z-срезов теряет временную согласованность, если сканирование занимает заметную долю длительности наблюдаемого события. В новой установке перемещение детекционной плоскости по глубине выполняет electrically tunable lens, ETL. Изменение оптической силы линзы напряжением устраняет инерцию перемещения тяжёлых объективов или столика и позволяет синхронизировать сканирование с камерой и элементами адаптивной оптики на миллисекундных временах.
В тракте использовано возбуждение на 488 нм и калибровочный канал 543 нм. Также присутствует датчик волнового фронта Shack–Hartmann. Его роль требует аккуратной трактовки. В предшествующей работе той же группы адаптивная оптика работала по sensorless-процедуре: качество изображения оптимизировалось по метрике изображения при изменении формы деформируемого зеркала, а Shack–Hartmann применялся для калибровки. Прямое измерение аберраций, внесённых самим биологическим образцом, в скоростном режиме пока не заявлено как завершённая функция. Авторы относят такое wavefront sensing к следующему этапу развития установки.
Это уточнение существенно для оценки результата. Электрически перестраиваемая линза способна вносить сферическую аберрацию, причём её величина зависит от оптической силы и положения фокуса. Одновременно вклад дают несовпадение показателей преломления, геометрия образца и рассеяние ткани. Адаптивная коррекция возвращает близкое к дифракционному пределу качество изображения для продемонстрированного режима, однако параметр нельзя переносить на весь объём, произвольную глубину и другие ткани. Прозрачные личинки данио-рерио представляют существенно более благоприятный объект, чем зрелая, плотная или сильно рассеивающая ткань.
Ценность работы заключена в согласовании трёх контуров: светового листа, быстрого z-сканирования ETL и коррекции волнового фронта. Камера получает последовательность срезов достаточно быстро, чтобы динамика кальциевого сигнала не превращалась в артефакт последовательной развёртки объёма. Следующий технический барьер определён физикой образца: для перехода к менее прозрачным тканям потребуются прямое измерение аберраций в поле зрения, устойчивая коррекция на разных глубинах и контроль потерь сигнала при росте скорости.